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气相色谱质谱联用法检测饲料中三聚氰胺的探讨

来源:    作者:    时间: 2011-06-28
 本文以气相色谱串联质谱联用法(GC-MS)测定饲料中违禁药物三聚氰胺的含量。试样中的三聚氰胺用三氯乙酸溶液提取,经混合型阳离子交换固相萃取柱净化,用N,O-双三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA)衍生化,以气相色谱质谱联用仪进行定性和定量。

    1 试剂与材料
    1.1 衍生剂
    N,O-双三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA);乙腈:色谱纯;甲醇:色谱纯;氨水:浓度25%~28%;混合型阳离子交换固相萃取柱:60mg,3mL;
    10g/L三氯乙酸溶液:称取三氯乙酸10g加水溶解定容至1 000mL;
    5%氨水甲醇溶液:量取氨水5mL,用甲醇定容至100mL容量瓶中;
    22g/L乙酸溶液:称取乙酸铅22g用约300mL蒸馏水溶解后定容至1 000mL容量瓶中;
20%甲醇溶液:量取甲醇200mL加入超纯水800mL,混匀;滤膜:0.45μm,有机相;三聚氰胺标准品(国家标准物质中心提供):纯度≥99%。
    1.2 三聚氰胺标准溶液
    三聚氰胺标准储备液:精确称取三聚氰胺标准品100mg,用20%甲醇溶液溶解并定容至100mL棕色容量瓶中,该溶液浓度为1.0mg/mL,于4℃冰箱内贮存,有效期3个月;
    三聚氰胺标准中间液:吸取三聚氰胺标准储备液5.0mL,用20%甲醇溶液定容至50mL棕色容量瓶中,该溶液浓度为100μg/mL,于4℃冰箱内贮存,有效期为1个月;
    三聚氰胺标准工作液:用移液管准确移取三聚氰胺标准中间液10mL,用20%甲醇溶液定容至100mL容量瓶中,该溶液浓度为10μg/mL,有效期为1周。
    1.3 仪器与设备
    气相色谱质谱联用仪(气质联用仪);离心机:10 000r/min;涡旋混合器:0~2 500r/min;超声波清洗器;氮吹仪:可控温至50℃;固相萃取装置(带真空泵)。

    2 测定步骤
    2.1 提取
    准确称取饲料样品5g(精确至0.0001g)至100mL具塞离心管中,准确加入10g/L三氯乙酸溶液50mL,加入22g/L乙酸铅溶液2mL,摇匀,超声提取30min,静止2min,取上层提取液约30mL转入50mL离心管中,置于离心机上10 000r/min离心10min,取至少15mL的样品上清液过0.45μm滤膜。
    2.2 净化
    分别用甲醇3mL,超纯水3mL活化混合型阳离子交换固相萃取柱,准确移取样品提取液10mL分次过柱,控制过柱速度在1.0mL/min以内;再次用超纯水3mL,甲醇3mL洗涤混合型阳离子交换固相萃取柱,抽至近干后用5%氨水甲醇溶液3mL洗脱;收集洗脱液于5mL具塞玻璃管中,置于氮吹仪上50℃氮气吹干。
    2.3 衍生化
    将已吹干的玻璃管内加入乙腈200μL,衍生剂200μL,置于涡旋混合器上充分混匀,放入70℃的培养箱内衍生反应30min;同时准确移取三聚氰胺标准工作液1.0mL于5mL具塞玻璃管中,氮气吹干后做同步衍生。

图1 三聚氰胺标准品衍生物选择离子色谱与质谱图

图2 三聚氰胺空白样品衍生物选择离子色谱与质谱图

图3 三聚氰胺添加样品衍生物选择离子色谱与质谱图

    2.4 测定
    2.4.1 GC-MS条件
    色谱柱:柱长30m,内径0.25mm,甲基苯基聚硅氧烷涂层,膜厚0.25μm;载气:氦气,流速为1.3mL/min;进样量:1μL;进样口温度:250℃;升温程序:起始温度75℃,持续1.0min,以30℃/min升温至300℃,保持2.0min;传输线温度:280℃;运行时间:10.5min;扫描范围:60~400m/z;扫描模式:选择离子扫描,监测离子99m/z、171m/z、327m/z、342m/z;离子源温度:230℃;EI源轰击能:70eV。
    2.4.2 测定
    定性方法:试样与标准品保留时间的相对偏差不大于0.5%,特征离子丰度与标准品相差不大于20%。定量方法:以342、327、171和99峰面积之和进行单点校正定量。
    2.4.3 结果计算和表述
    试样中三聚氰胺的含量X,以质量分数mg/kg表示,单点校正按以下公式计算:

    X=

    式中:
    A-试样溶液对应的色谱峰面积响应值;
    As-三聚氰胺标准溶液对应的色谱峰面积响应值;
    Cs-标准工作液中三聚氰胺的浓度,单位为μg/mL;
    V-用于衍生的试样溶液体积(5.3),单位为mL;
    m-试样质量,单位为g;
    n-稀释倍数。

表1  三聚氰胺标准品离散系数      %

序号 1 2 3 4 5 6 7 8
峰面积值 9 616 036  9 612 508 9 630 625 9 655 693 9 599 612 9 637 895 9 533 562 9 658 409
平均值
标准偏差
离散系数
9 621 417
41 725
0.43

表2  方法回收率与相对标准偏差      %

添加量
/(mg/kg)
 回收率 平均
回收率
标准偏差
1 2 3 4 5 6 7 8
2
5
10
25
91.8
96.2
95.7
98.3
93.2
95.8
97.8
97.6
94.5
93.8
98.2
99.1
92.9
94.6
98.1
98.2
94.8
93.7
97.6
97.9
93.6
94.9
98.9
98.5
92.7
95.3
98.6
98.5
91.7
96.6
98.4
98.7
93.2
95.1
97.9
98.4
1.06
1.00
0.92
0.44

    3 结果讨论
    3.1 样品加入50mL三氯乙酸溶液,再加入2mL乙酸铅溶液,样品的最终稀释倍数是52倍。
    3.2 因为三聚氰胺微溶于水中和甲醇中,所以样品加入三氯乙酸溶液后提取时间要充分,涡旋与超声提取的时间均不宜过短,超声提取后应再次涡旋混合均匀。
    3.3 通过表1可以看出,三聚氰胺标准品的离散系数为0.43%,表明此方法重复性好。
    3.4 通过三聚氰胺标准品衍生物选择离子色谱与质谱图中显示,三聚氰胺的出峰时间约在7.0min左右,但在实际检测中,每一进针时间不宜低于10.5min;利用载气流动相(氦气)的冲洗,可以将色谱柱中的残留物冲洗干净,以利于下一进针样品减少杂峰的出现。
    3.5 通过表2可以看出,三聚氰胺在饲料中的回收率在93.2%~98.4%,当添加浓度低时,回收率也会相应降低,当添加浓度提高时,回收率也随之升高;添加量在2mg/kg以上时,回收率基本上稳定在93%以上,添加量高于25mg/kg时,回收率的变化不会太大,基本上也稳定在98%~110%;但当添加量小于0.05mg/kg时,回收率会降至80%以下,甚至更低,而且会出现被测样品杂峰高于三聚氰胺峰的现象;通过回收率的测定值也可以证明此方法具有很好的可行性。
    3.6 此方法操作简单易行,单一样品的检测时间在30min左右,样品的提取也不是很复杂,还具有较高回收率与低离散系数等优点,并且本方法在样品处理液进行衍生时采用以乙腈代替吡啶的试验,也收到了很好的效果,减小了有机试剂对饲料检测人员的伤害,并且也可减小对环境的污染。
    3.7 在三聚氰胺样品处理液过混合型阳离子交换萃取柱时,过滤速度不宜太快,速度宜保持稳定;用氨化甲醇洗脱时,残留于混合型阳离子交换萃取柱中的溶液应尽量抽干;在实际检测中,有时会遇到样品处理液极难通过固相萃取柱,此种情况可能是被处理样品中含有较高的脂肪所造成的;这时就不宜再用3mL水来洗涤固相萃取柱,而改用50%甲醇水溶液3mL来预洗,再用纯甲醇3mL洗涤。
    3.8 试样溶液在被氮气吹干时,氮吹仪的温度不可过高,否则吹干后的试管壁颜色发黑;加入乙腈与衍生剂后,涡旋时间不宜过短。
    3.9 试样溶液在通过0.45μm有机滤膜过滤后,如果颜色混浊可以用滤膜再过滤一次,或者通过离心机离心使溶液清辙后再过滤0.45μm有机滤膜。
    3.10 三聚氰胺在上机检测之前,应将仪器充分预热,会较好的提高检测回收率与降低离散系数。
    3.11 每一针样品检测完毕后,应用乙腈充分清洗自动进样针,可以减小样品间的相互污染问题。
    3.12 回收率的测定按照公式进行计算,但不除以样品质量(即公式中m值);回收率是以添加的三聚氰胺标准中间液(3.12.2),浓度为100μg/mL的标准点添加到被测试样中;测定计算的标准品峰面积值(公式中的As值)是按照表1中标准品平均峰面积值进行比较计算的;此方法为外标定量法,具体参照中国国家农业行业标准“NY/T 1372-2007饲料中三聚氰胺的测定”中气相色谱串联质谱法的规定进行。
    3.13 标准品中三聚氰胺的出峰保留时间是在7.00min,当检测饲料样品时,饲料样品的保留时间与标准品的保留时间相对偏差不能大于0.5%,并且饲料样品的监测离子171m/z、327m/z、342m/z应与99m/z相比较,比例应当正常(参照标准品的监测离子比例);如果出峰时间超出偏差并且监测离子比例不当,应考虑不是三聚氰胺峰,而是样品杂峰。
    3.14 以气相色谱串联质谱法(GC-MS)与高效液相色谱法(HPLC)检测饲料中的三聚氰胺相比较时,GC-MS法最低检出限为0.05mg/kg,HPLC法最低检出限为2.0mg/kg,GC-MS法灵敏度要好于HPLC法;不过GC-MS法衍生过程的不确定因素较多,中间人员操作因素影响也较大,所以重现性与HPLC法相比要差一些。有研究表明:用HPLC法对323批次饲料样品进行三聚氰胺的检测,检出含三聚氰胺的饲料样品为56批,检出率高达17.33%,而用GC-MS法只检出8批次,检出率仅为2.47%,造成这种偏差的原因可能是由于饲料中的成分比较复杂,含有与三聚氰胺结构相似的物质,因此,饲料中三聚氰胺含量的检测用农业行业标准的GC-MS法较佳。
    (参考文献略)

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