农业部文件
农市发[2001]2号
关于发布饲料中盐酸克仑特罗的测定等5项行业标准的通知
各省、自治区、直辖市及计划单列市农业、农垦、畜牧、饲料工业主管厅（局、委、办），农业系统各有关国家级、部级质检中心及标准化技术归口单位，部直属各有关单位及标准起草单位：
《饲料中盐酸克仑特罗的测定》等5项标准业经我部审查批准为中华人民共和国行业标准，现予发布。各项标准的编号、名称如下：
一、强制性标准：
NY 438－2001 饲料中盐酸克仑特罗的测定
二、推荐性标准：
（一）NY/T439-2001 苹果外观等级标准
（二）NY/T440-2001 梨外观等级标准
（三）NY/T441-2001 苹果生产技术规程
（四）NY/T442-2001 梨生产技术规程
以上各项行业标准自2001年5月1日起实施。
二OO一年二月十五日
中华人民共和国农业部
中华人民共和国农业部行业标准
饲料中盐酸克仑特罗的测定
NY/TXXXX-XXXX
Determination of clenbuterol hydrochloride in feed
1 范围
本标准规定了以高效液相色谱 (HPLC仪和气相色谱－质谱 (GC-MS)仪测定饲料中盐酸克仑特罗的方法。
规定了GC-MS法为确证法（仲裁法）。
本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和预混合饲料中盐酸克仑特罗的测定与确证。HPLC法的最低检测限为0.5ng，(取样5g时，最低检测浓度为每千克试样0.05mg)。GC-MS法最低检测限为0.025ng，(取样5g时，最低检测浓度为每千克试样0.01mg)。
2 引用标准
下列标准中所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。
GB/T 14699.1-1993 饲料采样方法
GB/T 6682-1992 分析实验室用水规格和试验方法
3 HPLC法
3.1 方法提要
用加有甲醇的稀酸溶液将饲料中的克仑特罗盐酸盐溶出，溶液碱化，经液液萃取和固相萃取柱净化后，在HPLC仪器上分离、测定。
3.2 试剂和材料
以下所用的试剂和水，除特别注明者外均为分析纯试剂，水为符合GB/T 6682中规定的三级水。
3.2.1 甲醇: 色谱纯，过0.45µm滤膜。
3.2.2 乙腈: 色谱纯，过0.45µm滤膜。
3.2.3 提取液：0.5%偏磷酸溶液 (14.29g偏磷酸溶解于水，并稀释至1L) : 甲醇=80 : 20。
3.2.4 氢氧化钠溶液 c(NaOH)约2mol/L: 20g氢氧化钠溶于250mL水中。
3.2.5 液液萃取用试剂
3.2.5.1 乙醚。
3.2.5.2 无水硫酸钠。
3.2.6 氮气。
[1]3.2.7 盐酸溶液c(HCL)约0.02mol/L: 1.67mL盐酸用水定容至1L。
3.2.8 固相萃取 (SPE)用试剂
3.2.8.1 30mg/lmL Oasis® HLB固相萃取小柱1) 或同等效果净化柱。
3.2.8.2 SPE淋洗液：淋洗液-1：含2%氨水的5%甲醇水溶液； 淋洗液-2：含2%氨水的30%甲醇水溶液。
3.2.9 HPLC专用试剂
3.2.9.1 HPLC流动相：1mL1:1磷酸(优级纯)用实验室二级水稀释至1L，并按100:12的比例和乙腈（3.2.2）混合，用前超声脱气5min。
3.2.9.2 盐酸克仑特罗标准溶液
3.2.9.2.1 贮备液，200mg/mL：10.00mg盐酸克仑特罗(含C12H18Cl2N2O· HCl不少于98.5%)
溶于0.02mol/L盐酸溶液并定容至50mL, 储于冰箱中。有效期一个月。
3.2.9.2.2 工作液，2.00mg/mL：用微量移液器移取贮备液500mL以0.02mol/L盐酸溶液稀至50mL，储于冰箱中。
3.2.9.2.3 标准系列：用微量移液器移取工作液(3.2.9.2.2)25、50、100、500、1000mL，以0.02mol/mL盐酸溶液稀释至2mL，该标准系列中盐酸克仑特罗的相应浓度分别为：0.025、0.050、0.100、0.500、1.00mg/mL, 储于冰箱中。
3.3 仪器、设备
实验室常用仪器设备。
3.3.1 分析天平：感量0.0001g；感量0.00001g。
3.3.2 超声水浴。
3.3.3 离心机：能达4000r/min。
3.3.4 分液漏斗：150mL。
3.3.5 电热块或沙浴：可控制温度至（50～70）±5℃。
3.3.6 烘箱：温度可控制在70+±5℃。
3.3.7 高效液相色谱仪：具有C18柱４mm (如150mm×3.9mm ID)或类似的分析柱和UV检测器或二极管阵列检测器。
3.4 样品的制备
取具代表性的饲料样品，用四分法缩减分取200g左右，粉碎过0.45mm孔径的筛，充分混匀，装入磨口瓶中备用。
3.5 分析步骤
3.5. 1 提取：称取适量试样（配合饲料5g，预混料和浓缩料2g）精确至0.0001g，置于100mL三角瓶中，准确加入提取液 (3.2.3) 50mL，振摇使全部润湿，放在超声水浴中超声提取15min，每5min取出用手振摇一次。超声结束后，手摇至少10s，并取上层液于离心机上4000r/min下离心10min。
3.5.2 净化：准确吸取上清液10.00mL，置150mL分液漏斗中滴加氢氧化钠溶液(3.2.4)，充分振摇，调pH至11～12，该过程反应较慢，放置3~5min后，检查pH，如pH降低。需再加碱调节。溶液用30、25mL乙醚萃取两次，令醚层通过无水硫酸钠干燥，用少许乙醚淋洗分液漏斗和无水硫酸钠，并用乙醚定容至50mL。准确吸取25.00mL于50mL烧杯中，置通风橱内，低于50℃加热块或沙浴(3.3.6)上蒸干，残渣溶于2.00mL盐酸溶液 (3.2.7)，取1.00mL置于预先已分别用1mL甲醇和1mL去离子水处理过的SPE小柱上，用注射器稍稍加压，使其过柱速度不超过1mL/min，再先后分别用1mlSPE淋洗液-1和-2淋洗(3.2.8.2)，最后用甲醇洗脱，洗脱液置70±5℃加热块或沙浴上、用氮气吹干。
3.5.3 测定
3.5.3.1 于净化、吹干的样品残渣中准确加入1.00～2.00mL盐酸溶液（3.2.7），充分振摇，
超声，使残渣溶解，必要时过0.45mm的滤膜，清液上机测定，用盐酸克仑特罗标准系列（3.2.9.2.3）进行单点或多点校准。
3.5.3.2 HPLC测定参数设定：
色谱柱：C18 柱，150mm×3.9mmID，粒度 4mm 或类似的分析柱。
柱温：室温。
流动相：0.05%磷酸水溶液 : 乙腈=100 : 12（3.2.9.1），流速：1.0ml/min。
检测器：二极管阵列或UV检测器。
检测波长：210nm或243nm。
进样量：20～50mL。
3.5.3.3 定性定量方法
定性方法：除了用保留时间定性外，还可用二极管阵列测定盐酸克仑特罗紫外光区的特征光谱，即在210、243和296nm有三个峰值依次变低的吸收峰。
定量方法：积分得到峰面积，而后用单点或多点校准法定量。
3.6 分析结果的表述
每千克试样中所含盐酸克仑特罗的质量按式（1）计算
X=
m1
×D
m
----------- (1)
式中：X—每千克试样中盐酸克仑特罗的质量，mg；
m1－HPLC色谱峰的面积对应的盐酸克仑特罗的质量，mg；
D—稀释倍数；
m—所称量的样品质量，g。
结果表示至小数点后1位。
3.7 允许差
取平行测定结果的算术平均值为测定结果，两个平行测定的相对偏差不大于10%。
4. <![endif]>GC-MS 法（确证法，仲裁法）
4.1 方法提要
用加有甲醇的稀酸溶液将饲料中的克仑特罗盐酸盐溶出，溶液碱化，经液液萃取和固相萃取柱净化后，在GC-MS联用仪上分离、测定。
4.2 试剂和材料
以下所用的试剂和水，除特别注明者外均为分析纯试剂，水为符合GB/T 6682中规定的三级水。
4.2.1 提取净化用试剂：同HPLC法中 3.2.1~3.2.8。
4.2.2 衍生剂：N，O—双三甲基甲硅烷三氟乙酰胺(BSTFA)。
4.2.3 甲苯。
4.2.4 盐酸克仑特罗标准溶液
4.2.4..1 贮备液，200mg/mL：10.00mg盐酸克仑特罗(含C12H18Cl2N2O· HCl不少于98.5%)溶于甲醇并定容至50mL,储于冰箱中。有效期三个月。
4.2.4.2 工作液，2.00mg/mL：用微量移液器移取贮备液(4.2.3.1)500mL以甲醇稀释至50mL, 储于冰箱中。
4.2.4.3 标准系列：用微量移液器移取工作液(4.2.3.2)25、50、100、500、1000mL，以甲醇稀释至2mL，该标准系列中盐酸克仑特罗的相应浓度为：0.025、0.050、0.100、0.500、1.00mg/mL,储于冰箱中。
4.3 仪器、设备
4.3.1 样品前处理设备同HPLC法3.3.1~3.3.7。
4.3.2 GC-MS联用仪：装有弱极性或非极性的毛细管柱的气相色谱仪和具电子轰击离子源及检测器。
4. 4 样品的制备
同HPLC法(3.4)。
4.5 分析步骤
4.5.1 提取 同HPLC法3.5.1。
4.5.2 净化 同HPLC法3.5.2。
4.5.3 测定
4.5.3.1 衍生：于净化、吹干的样品残渣中加入衍生剂BSTFA(4.2.2) 50mL，充分涡旋混合后，置70℃±5℃烘箱中，衍生反应30min。用氮气吹干，加甲苯（4.2.3）100mL，混匀，上GC-MS联用仪测定。同时用盐酸克仑特罗标准系列(4.2.4.3)做同步衍生。
4.5.3.2 GC-MS测定参数设定：
色谱柱：DB-5MS, 30m×0.25mm ID 0.25µm。
载气：氦气， 柱头压：50 KPa。
进样口温度：260℃。
进样量：1mL，不分流。
柱温程序：70℃保持1min，以25℃/min速度升至200℃，于200℃保持6min，再以25℃/min的速度升至280℃并保持2min。
EI源电子轰击能：70eV。
检测器温度：200℃。
接口温度：250℃。
质量扫描范围（AMU）：60～400。
溶剂延迟：7min。
检测用克仑特罗三甲基硅烷衍生物的特征质谱峰：
M/Z=86、187、243、262。
4.5.3.3 定性定量方法
定性方法：样品与标准品保留时间的相对偏差不大于0.5%。特征离子基峰百分数与标准品相差不大于20%。
定量方法：选择离子监测 (SIM) 法计算峰面积，单点或多点校准法定量。
4.6 分析结果的表述
每千克试样中所含盐酸克仑特罗的质量按式（2）计算
X=
m2
×D
m
---------- (2)
式中：X—每千克试样中盐酸克仑特罗的质量，mg；
m2－GC-MS色谱峰的面积对应的盐酸克仑特罗的质量，mg；
D—稀释倍数；
m—所称量的样品质量，g。
结果表示至小数点后1位。
4.7 允许差
取平行测定结果的算术平均值为测定结果，两个平行测定的相对偏差不大于20%。
1 ) Oasis® HLB固相萃取小柱是由 Waters Corperation (34 Maple Street Milford MA,USA)提供的产品的商品名称,给出这一信息是为了给本行业标准的使用者提供方便,而不是标准主管部门对这一产品的认可。
