氨基酸分析仪测定饲料及其原料中的含硫氨基酸

摘 要：本文采用过甲酸氧化水解法处理饲料及饲料原料样品、通过日立L-8900氨基酸自动分析仪检测样品中的含硫氨基酸含量，结果显示：每份试样平行测试结果相对偏差小于4％，蛋氨酸和胱氨酸峰面积回收率在93.02％～102.06％，该方法测定含硫氨基酸的重复性和准确性良好，氧化水解法比常规盐酸水解法处理样品检测含硫氨基酸，检测结果更为准确。
    关键词：氧化水解；含硫氨基酸；饲料；饲料原料；氨基酸分析仪

    1 引言
    用于全氨基酸测定的样品，凡是以蛋白质形式存在的都要进行水解处理，水解方法有3种：
    一是酸水解法（6mol/L盐酸溶液、110℃真空水解24h）。即标准水解法，是普遍采用的水解方法，此方法的特点是水解彻底，但色氨酸遭破坏，不能测量；含硫氨基酸部分氧化，不能测准。
    二是碱水解法。用NaOH（LiOH、Ba（OH）2）作为水解剂，色氨酸不被破坏，主要用于HPLC法测色氨酸。
    三是氧化水解法。将含硫氨基酸（如：胱氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸）用过甲酸氧化变成稳定物质，然后再进行酸水解。
    饲料及原料中的含硫氨基酸（蛋氨酸和胱氨酸）是畜禽生长的必需氨基酸，为能充分利用饲料原料中的蛋氨酸和胱氨酸，必须准确测定二者的含量，以便合理地配制畜禽日粮。蛋氨酸和胱氨酸的检测，必须采用过甲酸氧化，使之转变为其氧化物蛋氨酸砜和磺基丙氨酸，所生成的这些对酸稳定的氧化物，再通过盐酸水解法从蛋白质中释放出来，用离子交换色谱法（氨基酸分析仪）分离测定。

    2 试验部分
    2.1 仪器与设备
    L-8900氨基酸分析仪，电子分析天平，实验室超纯水机，电热鼓风干燥箱，真空干燥箱。
    2.2 药品与试剂
    柠檬酸钠（AR），氯化钠（AR），氢氧化钠（AR），盐酸（GR），冰乙酸（GR），蛋氨酸砜标准品（Sigma），磺基丙氨酸标准品（Sigma）。
    过甲酸溶液：将30％过氧化氢与88％甲酸按1:9（V/V）混合，室温放置1h，置冰水浴中冷却30min，临用前配制。
    氧化终止剂：48％氢溴酸。
    酸解剂：7.2mol/L盐酸溶液（将3体积优级纯盐酸与2体积超纯水混合）。
    磺基丙氨酸－蛋氨酸砜标准贮备液：准确称取磺基丙氨酸105.7mg和蛋氨酸砜113.3mg，加水溶解并定容至250mL，各组分浓度分别为2.5umol/mL。
    氨基酸混合标准贮备液：含有L-天门冬氨酸等17种常规蛋白质水解分析用氨基酸，各组分浓度为2.5umol/mL。
    2.3 试验样品
    取具代表性的饲料及原料样品（来自广东海大集团股份有限公司），用四分法缩减、粉碎并过40目筛，充分混匀，备用。
    2.4 试验步骤
    2.4.1 样品前处理
    准确称取50～70mg试样双份于25mL水解管中，在冰水浴中冷却30min后，加入已冷却的过甲酸溶液2mL，待样品全部润湿（不能摇动），盖好试管塞，连同冰浴一起置于0℃冰箱中，反应18h。
    于各管中加入氢溴酸0.3mL，振摇，放回冰浴静置30min，取出，放至室温后，加入10mL盐酸酸解剂，真空泵抽真空约1min，冲入普通氮气约1min，盖紧试管盖，置于110℃恒温鼓风干燥箱中，水解24h。
    取出水解管，冷却，用水定容至100mL。充分混匀，滤纸过滤，准确吸取1mL于10mL烧杯中，并于真空干燥箱，蒸发至干。加入2mL 0.02mol/L盐酸溶液，充分溶解，0.2um滤膜过滤，上机。
    2.4.2 色谱条件
    按日立公司的操作手册要求配制标准分析用pH1#、2#、3#、4#、5#洗脱溶液和茚三酮试剂R1、茚三酮缓冲溶液R2。泵1（洗脱溶液）流速：0.40mL/min（压力2.0～14.7MPa）；泵2（茚三酮溶液）流速：0.35mL/min（压力0.2～2.0MPa）；分析柱温度：57℃；反应器温度：135℃；进样体积：20μL。检测波长为570nm，其中脯氨酸检测波长为440nm。
    2.4.3 样品中含硫氨基酸的测定
    按外标法，将各样品经氨基酸自动分析仪检测所得的蛋氨酸和胱氨酸色谱峰面积代入其相应的标准曲线方程，求得不同组分样品中蛋氨酸和胱氨酸的含量。

    3 结果与讨论
    3.1 氨基酸分析仪分析条件的选择 
    日立L-8900氨基酸分析仪包括6部分：输液单元（泵与管路）——输送缓冲液、反应液在流路系统中流动；进样单元（自动进样器）——将样品在流动相的带动下送入仪器体系中；分离单元（离子交换柱、柱温箱）——主要是样品的分离、将混合的样品分离成单一组分；反应单元（反应柱、反应温度加热设备）——被分离的单一组分物质与反应液在反应单元反应，生成可检测物质；检测单元（分光光度计）——准确检测单一组分物质的电能信号（mv）；程序控制、数据处理（工作站）——仪器的运行程序控制、检测结果的处理。其中心部件是填料为3μm磺酸型阳离子树脂分离柱，带有大量负电荷。所有的氨基酸在低pH值的条件下都带有正电荷，在阳离子交换树脂上均被吸附，但吸附的程度不同，碱性氨基酸结合力最强，其次为芳香族氨基酸，中性氨基酸、酸性氨基酸结合力最弱。
    L－8900氨基酸分析仪采用梯度洗脱，梯度洗脱液有6种： B1～B4为柠檬酸盐缓冲液，pH值分别为3.3、3.2、4.0和4.9，B5是超纯水，B6是再生液（0.8％氢氧化钠溶液）。每种氨基酸分辨率在1.2以上，真正完全分离（图1）。

图1 蛋白盐水解液分析色谱图

    常规盐酸水解氨基酸测定条件下，测氧化水解形成的蛋氨酸砜时，蛋氨酸砜和天冬氨酸不能分开（图2）。

图2 蛋白过氧化水解液分析色谱图
注：本分析程序在蛋氨酸砜出峰完全后停止分析。

    蛋氨酸砜和天冬氨酸的分离决定于缓冲液B1的pH值。调整B1的pH值（减少柠檬酸钠的用量），直到蛋氨酸砜和天冬氨酸分辨率为1.2以上（图3），此时B1的pH值为3.0。

图3 调整B1之pH值后的过氧化水解液色谱图

    调整B1的pH值为3.0后，甘氨酸和丙氨酸分辨率下降，不能分开，根据仪器说明书，延长B1－B2切换时间，直到甘－丙氨酸分辨率在1.0以上，且确保其他氨基酸组分间分辨率均在1.0以上（图4）。

图4 调整B1-B2切换时间后的过氧化水解液色谱图

    L-8900氨基酸分析仪采用前置式设计操作比较方便，打开前门可以进行缓冲液、反应液和分离柱的更换、废液的处理及进行仪器的日常维护保养。反应试剂是在与氨基酸反应前才将两种反应液R1、R2进行实时混合，有效的延长了反应液的使用期限、不需要额外的制冷装置存放。在泵后、进样器前连接了日立除氨柱，它能很好的排除氨的存在对于分析过程中对基线及峰形的干扰。系统内使用氮气保护器对缓冲液进行隔离、对反应液进行保护、可防止氧化、延长反应液的使用时间以及避免由于氧气进入缓冲液影响个别氨基酸的分析结果。试剂配方公开、可自行配制不需冷藏保存。
    在选定的色谱条件下，磺基丙氨酸和蛋氨酸砜的保留时间分别为1.39min和5.06min，保留时间的相对标准偏差小于1.58%。本检测方法能有效地分离鉴定蛋氨酸和胱氨酸，目标峰与组织样品中的其他峰分离良好。
    3.2 含硫氨基酸检测准确性和回收率实验
    3.2.1 检测平行性
    同一批次两次平行测定结果的相对偏差在1％以内，在允差（4％）范围内。
    3.2.2 回收率的测定
    对检测样品进行加标回收率测试，结果显示磺基丙氨酸和蛋氨酸砜峰面积加标回收率在93.02％～102.06％。

表1 回收率的测定

样品	磺基丙氨酸峰面积	回收率	蛋氨酸砜峰面积	回收率
标准	3856381	102.06％	3808379	93.02％
样品＋标准	1010117		5106789
样品	616745		1564043

    从蛋氨酸和胱氨酸检测的平行性和样品的加标回收率可以看出，该检测方法可靠，重复性良好，其准确度和精密度均符合检测分析的要求。
    3.3 饲料和原料中的胱氨酸测定结果

表2 饲料和原料中的胱氨酸测定结果

样品名	印度豆粕	棉粕	花生粕	菜粕	DDGS	鱼粉	鸭料
胱氨酸/％	1.02	1.07	0.86	1.40	1.04	1.18	0.64

    3.4 饲料和原料中蛋氨酸测定结果

表3 饲料和原料中蛋氨酸测定结果

    以上结果看出：氧化水解后，植物性蛋白质原料及饲料中蛋氨酸结果提高较多，动物性蛋白质原料及饲料中提高较少，可能与其结构有关。所以，只需对植物性蛋白原料及饲料进行过甲酸氧化水解，然后常规盐酸水解样品。

    4 结论
    采用过甲酸氧化水解法处理饲料及饲料原料样品、通过日立L-8900氨基酸自动分析仪检测样品中的含硫氨基酸（蛋氨酸和胱氨酸），优化了氨基酸分析色谱条件，蛋氨酸和胱氨酸得到很好的峰形，与样品中的其他峰分离良好，且结果重现性好，回收率高。
    对样品进行氧化水解，能较准确测出样品中蛋氨酸和胱氨酸含量，特别是对植物性蛋白质原料及饲料样品，进行氧化水解比常规酸水解，检测得出的蛋氨酸含量要高，对正确指导研发和生产工作具有重大意义。

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