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乳品中抗生素的检测方法

  作者: 来源: 日期:2003-01-01  

  乳品中抗生素的检测方法

  王庆忠 蒲彪

  (四川农业大学信息与工程技术学院,四川省雅安市 625014)

  摘要:本文对检测抗生素的3种主要方法:微生物法、酶法和色谱法的设计原理和筛选策略进行了分析。论述了BSDA 、Charm Farm、Charm Cowside、Penzyme、Delvotest P、CITE Probe、Lactam Test Kit等检测方法的研究历史。比较和分析了多种方法的检测敏感性、特异性和影响检测的可能因素。最后就如何提高我国乳品的抗生素检测水平,提出了建议措施。

  关键词:抗生素 检测 原理 筛选 BSDA 试剂盒

   经多年的实践,人们认识到抗生素可以增强牲畜抗病能力、提高养殖业产投比。但过量使用,将降低畜牧产品品质,影响乳品发酵。而含有抗生素残留的动物性产品,进入人类食物链,会使体内菌株产生抗生素抗性,扰乱机体内环境平衡,菌群失调而不利于健康;也会对易感人群产生过敏反应、激素障碍变态反应。因此,FAO及WHO早在1969年就提出应规定各种动物性食品中的抗生素残留允许标准,WHO于1979年规定原料奶及消毒牛奶中不得有抗生素。近年来,国内对奶制品中的抗生素残留也非常关注,无抗奶(Antibiotic-Free Milk)的生产和消费已成为大势所趋。但我们对奶制品中抗生素的检测缺乏必要的研究,检测技术还十分落后。本文旨在对抗生素的检测方法进行总结,为在我国开展相关工作奠定基础。

  1 检测原理

  传统检验方法是基于抗生素残留对微生物生长的抑制,以扩散过程或浑浊度为基础。抗生素浓度越高,微生物的生长受抑制程度越大,菌落越小。STOP法(当场棉拭检验)以枯草芽孢杆菌(ATCC6633)32℃下培养16-18小时测定抗生素;CAST法(兽崽抗生素和磺胺制剂实验)则是接种巨大芽孢杆菌(ATCC9885)在44℃下培养;而BSDA法(B.stearothermophilis tablet Disc Assay,嗜热脂肪芽孢杆菌圆盘检验法)则采用嗜热脂肪芽孢杆菌。

  免疫检验法是对抗抗生素抗体的检验。基于抗生素刺激动物产生相应的应急反应,从而形成抗体。通过抗原-抗体的特异性结合,确定抗生素含量。该方法的引申是通过细胞质表皮因子(Surface Plasmon Resonance,SPR)对抗生素的特异结合,测定相应的酶活性或基质的电流变化,从而推算抗生素浓度,以实现自动化检测。

  使用高效液相色谱(HPLC)和质谱(MS)对抗生素进行定量、定性的测定,主要是基于它们测定痕量物质的优越性。

  Andrew[1]总结了6家公司8种检测试剂盒的检测原理,见表1。可看出有一半检测试剂盒是采用抑制微生物生长的原理而设计的。

  表1 不同检测试剂盒工作原理

  试剂盒 生产厂家 分析原理

  Charm Farm Charm Science, Inc. (Malden,MA) 抑制微生物生长

  Charm Cowside Charm Science, Inc. 青霉素竞争性吸附展示

  Delvotest P Gist-brocade Food Ingredients, Inc. 抑制微生物生长

  Penzyme SmithKline Beecham Animal Health 酶反应

  CITE Probe ICEXX Laboratories, Inc. 抗原-抗体吸附

  Lactam Test Kit Idetek, Inc. 竞争性酶联免疫

  Valio T101 Valio Finland, Research and Development Centre 抑制微生物生长

  Charm BSDA Charm Science, Inc. 抑制微生物生长

  2 检测方法筛选策略

  FDA兽医学中心规定,检测方法敏感性要强,特异性要高。某项方法如要成为法定方法,其检测的最低限值应该在95%置信度的情况下,检测FDA规定的安全浓度或允许浓度(safe or tolerance level,欧盟称为MRL,Maximum Residue Limits)可能性要大于90%。可以采取以下策略筛选和评价检测方法[2]:

  第一步,初步评价敏感性和特异性。测定特异性时,选择绝对不含抗生素的样品,其中体细胞数量(Somatic Cell Count,SCC)要<106/ml,结果为阴性。测定敏感性时,则在奶样中添加MRL水平的抗生素,结果为阳性。

  第二步,测定最底检测限。使用30-60个样本,其中的抗生素含量一般间于20%MRL到2倍MRL水平,绘制检测方法对不同抗生素的标准曲线。

  第三步,评价影响因素。采用含有内毒素,且SCC含量间于2×106-6×106个/ml的奶样,特异性要达到90%以上。

  第四步,现场检验。各种类型(地区、牧场规模、抗生素类型)的奶样的广泛检测,检测结果同HPLC对照。

  由此,FDA在M-a-85备忘录中将Charm BSDA等15种方法规定为法定检测方法(见表5)。

  3 几种典型的检测方法

  按照检测原理和使用的仪器,抗生素的检测方法可分三类:酶法、微生物法和色谱法。

  3.1 微生物法

  3.1.1 BSDA法

  最常用的是BSDA法,采用嗜热脂肪芽孢杆菌对抗生素的耐受程度作为检测指标。Kang-KH[3]分别采用嗜热脂肪芽孢杆菌、藤黄链球菌(Micrococcus luteus )、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus )等3种细菌检测抗生素,它们对青霉素的检测低限分别为0.0025 U/ml、0.01 U/ml和0.03 U/ml。

  Ueta[4]用纸圆盘法检测抗生素,76个无抗生素的奶样中有48个为抗生素阳性,而使用TTC和Delvotest P检测却为阴性。

  3.1.2 试剂盒法

  Delvotest P试剂盒是依据嗜热脂肪芽胞杆菌的生长对培养基颜色的改变为测试指标,黄色为阴性,紫色为阳性(青霉素检出限度为0.003 U/mL)[5]。

  TTC(氯化三苯基四氮唑法)同样依据显色状态判断结果,未显色者为阳性,微红色者为可疑;桃红色或红色者为阴性。其检测低限见表2。

  表2检测各种抗生素的检测底限

  抗生素名称 最低捡出量(U/ml)

  青霉素 0.004

  链霉素 0.5

  庆大霉素 0.4

  卡拉霉素 5

  3.1.3 试管改进法

  Stadhouders[6]电泳法检测抗生素。奶样经丙酮和HCl提取,琼脂凝胶电泳,后经嗜热脂肪芽孢杆菌55℃下3-3.5h,或蜡状芽孢杆菌变种(B. cereus subsp. mycoides )30℃下18-24h,生物显影,测定抗生素浓度。

  Nouws-JFM[7]用改进试管法检测四环素、嘧啶、大环内酯类抗生素、利福霉素、三甲氧苄二氨嘧啶和氨基糖苷类抗生素,检测菌种为嗜热脂肪芽孢杆菌,检测低限在欧盟MRL之下。

  Shitandi[8]用荷兰试管扩散法检测抗生素,与BSDA法比较,多管法可提高准确度。

  3.2 酶免疫法

  Bleile-DM[9]采用高特异性的单克隆和多克隆抗体检测β-内酰胺抗生素,仅需8分钟,对青霉素-G和先锋霉素Ⅳ的检测低限分别为5 ng/ml、10 ng/ml。

  Jackman[10]采用竞争性ELISA检测青霉素-G,分析内可变性(intra-assay variation)为5.3%,分析外可变性(interassay variation)为5.4% ,均符合规定。

  Weber[11]使用Fluorophos BetaScreen 4p test 和 FLM200 fluorometer检测脱脂乳、酪乳、UHT奶和巧克力奶中的青霉素-G、氨苄青霉素、阿莫西林、邻氯青霉素和催产素, 检测低限在MRL附近,特异性间于 94%-100%。

  Kumar[12]使用固相荧光免疫法测定β-内酰胺抗生素 (青霉素-G、氨苄青霉素、阿莫西林、 邻氯青霉素和先锋霉素Ⅳ)。荧光物质采用Cy-55,固相为SiO2毛细管,检测时间<3分钟,检测底限达ppb水平。

  Zhi-ZL等[13]使用一种自动流体免疫检测系统检测先锋霉素Ⅳ,检测底限为1ug/l,回收率为97.3%。

  3.3 生物传感器法

  Gaudin[14]采用BLACORE检测磺胺二甲基嘧啶(SMZ)。即将SPR上的改性羧甲基葡聚糖金属结合传感器为检测因子,检测SMZ。SMZ在0-200 ug/kg之间,两者存在线形关系;检测时间8-30分钟;检测底限达到1.7ug/kg。并行多孔检测,可同时检测青霉素、四环素、氯霉素和氨基糖苷类抗生素。

  Setford[15]将能特异吸附青霉素-G的蛋白质固定在基质上,青霉素-G同蛋白质结合,引起电流的变化,从而推算其浓度。本方法时间短,灵敏、试剂少,很适合野外操作。

  Gustavsson[16]用SPR上具羧肽酶活性的蛋白质为检测因子,β-内酰胺抗生素的含量同它的活性之间存在线形关系。本方法可解决ELISA流量小,微生物法只测活性成分的缺点,并能实现自动检测。对青霉素-G的最小检测限为2.6 ug/kg,3日检测变动率间于7.3%-16%。

  3.4 HPLC

  Dasenbrock[17]采用HPLC-IPAD (Integrated Pulsed Amperometric Detection,脉冲电流检测)测定氨苄青霉素和先锋霉素Ⅳ,快速、简便。先锋霉素Ⅳ浓度为40、20和10 ppb 时,提取率分别为74%、80%和77%。而氨苄青霉素浓度为20、10和5ppb时,提取率为67%、78%和75%。

  4 检测方法比较

  很多学者研究了不同检测方法的敏感性、特异性和使用便捷性。

  Macaulay[18]采用5种检测方法:(i) Charm test; (ii) Delvotest P; (iii) Bacillus subtilis在乳清琼脂上的生长; (iv) Bacillus subtilisas抗生素基质上的生长; (v) Difco测定青霉素、红霉素和四环素。结果见表3,iv、v两法更为灵敏。

  表3 不同测定方法对抗生素的检测低限

  检测方法 青霉素(U/ml) 红霉素(mg/ml) 四环素(mg/ml)

  i 0.025 — —

  ii 0.025 6.75 20

  iii 0.05 6.75 20

  iv 0.05 1.68 20

  v 0.05 1.68 20

  Senyk[19]采用Angenics Spot Test, Charm II, Delvotest P, Penzyme Farm and Penzyme Lab III等5种快速检测法,对10种抗生素:青霉素-G、先锋霉素Ⅳ、链霉素、氨苄青霉素、阿莫西林、氯霉素、红霉素、新新霉素、四环素和庆大霉素进行检测。通过对5个浓度,8个样品的测定,同BSDA法相比,各检测方法都达到法规的要求。

  Carlsson[20]研究Arla microtest、Valio T101、Delvotest SP和Charm II 4种方法。经气相色谱证实,当自由脂肪酸(FFA)浓度达到 4-5mM时,Arla microtest和Valio T101对四环素和大环内酯抗生素的测定可能出现假阳性,而Delvotest SP 和CharmII则不会。

  Eenennaam[21]通过5种检测方法对172头奶牛样品的检测发现,Charm Farm、CITE R probe、Delvotest-P、BSDA、LacTek等5种方法的假阳性率从高到低依次为为81.7%、43.6%、37.7%、18.8%和2.6%。影响结果的最大因素为SCC。5种方法的敏感性、检测性和特异性见表4。

  表4 5种检测方法的敏感性、检测性和特异性(%)

  检测方法 敏感性 检测性 特异性

  CITE probe (beta-lactam) 85 72 30

  Delvotest-P 97 82 38

  Charm Farm 100 100 9

  LacTek 93 93 99

  BSDA 97 96 61

  Hozova-B[22]的研究表明BSDA、INTEST和 DelvotestP 等3种方法在检测青霉素、氯霉素、四环素和链霉素时,各方法之间的重合性较好,符合EU和IDF检测MRL的要求。

  Zeng-SS[23]使用Delvotest P、Penzyme 和BSDA检测羊奶中的抗生素。表明:检测青霉素-G和先锋霉素Ⅳ,Delvotest P存在7%的假阳性率;Penzyme无假阳性,后者更为敏感、特异和快速。

  Andrew[1]研究了Delvotest P、 Charm Cowside、Charm Farm、 Penzyme、Valio T101、LacTek、CITE Probe、Charm Bacillus stearothermophilus disk assay等方法,认为除CITE Probe法以外,其它方法的正确率达到90%以上。

  Gardner[2]研究了FDA规定的15种检测方法,认为不同方法对不同抗生素检测低限不一样;检测特定的青霉素需要相应方法。从表5可以看出对青霉素、氨苄青霉素、阿莫西林、青霉素Ⅳ的检测,除Lactam Test Kit CFF法以外,其它方法都可完成;能检测头孢霉素的有Charm II Competitive、Charm Farm等11种方法;但可检测对邻氯青霉素的只余下Charm II Tablet Quantitative、Lactam Test Kit B-L等3种方法。

  表5 各种方法的检测低限(ppb)

  检测方法 青霉素 氨苄青霉素 阿莫西林 邻氯青霉素 青霉素Ⅳ 头孢霉素

  允许或安全浓度 5 10 10 10 20 50

  Charm II Competitive 4.8 9.0 10.0 70.0 4.5 25.0

  Charm Farm 5.0 10.0 10.0 40.0 20.0 25.0

  Charm II Tablet Sequential 4.8 8.0 10.0 50.0 4.5 23.0

  Charm II Tablet Transit 4.8 9.0 10.0 80.0 4.5 13.0

  Charm Rapid Inhibition 3.0 4.5 4.5 25.0 16.0 50.0

  Charm II /Cowside Tablet 4.8 4.0 10.0 50.0 8.0 40.0

  Charm II Tablet Quantitative 4.8 8.0 10.0 10.0 4.5 23.0

  Charm BSDA 5.0 6.5 10.0 48.0 11.0 75.0

  Delvotest Test P 3. 4.0 8.0 30.0 8.0 50.0

  Delvo-X-Press 5.0 4.0 10.0 50.0 10.0 10.0

  Lactam Test Kit B-L 5.0 8.0 10.0 5.0 16.0 未检测

  Lactam Test Kit CFF 未检测 未检测 未检测 未检测 未检测 50.0

  Penzyme III 5.0 4.0 8.0 80.0 8.0 80.0

  Penzyme Milk 5.0 4.0 8.0 80.0 8.0 80.0

  Snap Test 5.0 4.0 10.0 50.0 8.0 50.0

  5 影响因素

  由于乳制品组分的多样性,各种抗生素在动物体内代谢的复杂性,以及各检测方法的不同检测原理,会影响检测结果。最常见的就是假阳性和假阴性问题。

  Okada[24]的研究表明在SCC浓度低的情况下,有10.2%的假阳性率;而当SCC浓度>3×106/ml时, 假阳性率增加到19.7%。

  Carlsson[25] Delvotest P的假阳性率上升同动物体内的自然抗生素的浓度呈线形关系。这些自然抗生素主要是乳铁蛋白(lactoferrin)和溶菌酶(lysozyme)。

  Cullor[26]在美国乳品生产联盟和美国兽医协会的合作的研究中,发现当时的检测方法假阳性率太高,需进一步改进。

  Angelidis[27]在研究Delvo-X-Press对β-内酰胺的测定时发现,当奶样中的乳铁蛋白(bovine lactoferrin)>1 mg/ml时,可导致假阳性; SCC也可导致相同结果。当SCC>106/ml时,与假阳性呈线形关系(r = 0.61,P<0.01)。

  Suzanne[28]认为用BSDA检测抗生素,实验时的琼脂层厚度、菌株菌龄、加样技术和样品中的内含物都可能影响测定结果。而采用TTC法,时间长,肉眼辨别,易产生误差。

  为了控制假阳性或假阴性,Gardner[2]建议采用至少两种检测方法,第一种为便宜的高敏感性的方法;第二种为高特异性(>99%)的以确证结果。

  6 结语

  我国关于奶制品中抗生素检测的国家标准方法最早出现在《牛乳检验方法——GB5409—85》中,采用TTC法。1994年制订的《食品卫生微生物学检验 鲜乳中抗生素残留量检验——GB/T 4789.27—1994》,也采用TTC法。2001年9月,农业部发布的《无公害食品生鲜牛乳》行业标准中,检测方法同《GB5409—85》,并不得检出。《绿色食品消毒牛乳标准》也做了类似规定。可看出,我国还未将抗生素纳入常规检测,作为必检项目;所采用的TTC法精确性和时效性都比较差。

  展望新世纪的乳制品工业,为了保障人体健康,适应WTO的要求,增强国内乳制品业的国际竞争力,必须将抗生素的检测纳入议事日程。

  首先是要制定相应的法规和检测程序,将乳制品中抗生素的检测、报告、处罚和管理等纳入法制化轨道,适应市场经济就是法制经济的要求。

  其次是要修订、制订乳制品标准,将抗生素的检测纳入国标体系。解决国内标准混乱,与国际标准冲突的问题,加大采用国际标准的比例,同国际标准接轨。

  再次是要进行抗生素检测方法筛选工作,提高国产试剂盒的研制能力。努力研究发展一些简单、快速、经济和便携化的能检测多种抗生素残留的分析技术;发展高效、高灵敏的联用技术和多残留组分确证技术。

  相信通过以上措施将提高我国乳制品抗生素检测水平,为该行业的健康发展提供有力的保障。

  

 
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